La Green Fluorescent Protein (GFP)

La protéine GFP a initialement été isolée de la méduse Aequorea victoria en 1962 par Shimomura et coll. Son gène a été cloné en 1992 par Prasher et coll.

La GFP est une protéine de 238 acides aminés, acide, compacte et globulaire, possédant une masse moléculaire de 27 kDa. De nombreux mutants de la GFP sauvage ont pu être isolés par chromatographie échangeuse d'ions ou focalisation isoélectrique. D'autre part, des mutants de la GFP présentant un gain de fonction, c'est-à-dire une augmentation de l'intensité de la fluorescence, ont été générés par différentes techniques. Ainsi, la substitution du codon sérine 65 par un codon thréonine dans le clone GFP-S65T décale la longueur d'onde d'excitation en un unique pic à 490 nm. Afin d'obtenir une expression plus importante chez les cellules humaines ou d'autres mammifères, un clone dénommé hGFP-S65T, possédant des codons " humanisés ", a été réalisé par Zolotukhin et coll. en 1996. Le gène gfp sauvage contient plusieurs codons qui ne sont pas communément utilisés chez les mammifères : plus de 190 mutations silencieuses y ont ainsi été incorporées. Ces mutations permettent d'obtenir une protéine 35 fois plus fluorescente que la GFP sauvage et 5 à 10 fois plus exprimée dans les cellules de mammifères. L'expression endogène ou hétérologue de la GFP ne requiert l'addition d'aucun groupe prosthétique (protéines, substrats ou co-facteurs d'Aequorea) pour être fluorescente. Elle acquiert ses propriétés de fluorescence par un mécanisme autocatalytique de formation du fluorophore. La GFP a été exprimée de manière hétérologue dans des cellules et organismes aussi divers que les bactéries, les levures, les cellules eucaryotes animales et végétales.

Ressources
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A voir absolument, car ce site recèle de vrais trésors !!
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Pour les débutants... et les autres
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Toutes les mutations de la GFP
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Structure de la GFP
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De nombreuses infos sur la GFP par Clontech
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Animation de la structure 3D de la GFP
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Fiche SwissProt sur la GFP

Ressources bibliographiques
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Green fluorescent protein. Porperties, applications, and protocols. Edited by Martin Chalfie and Steven Kain. John Wiley & Sons, Inc., publication. ISBN 0-471-17839-X
Une référence en la matière !
Inouye, S et al. "Aequora green fluorescent protein expression of the gene and fluorescence charcteristics of the recombinant protein." FEBS Letters 341:277-280, 1994.

Branchini BR et al. "A computational analysis of the unique protein induced tight turn that results in posttranslational chromophore formation in green fluorescent protein." Journal of the American Chem Society 120(1), 1998.

Stauber RH et al. "Development and applications of enhanced freen fluorescent protein mutants." BioTechniques 24(3):462-471, 1998.

Patterson, G et al. "Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy." Biophysical Journal 73:2782-2790, 1997.

Valdivia and Falkow"Fluorescene-based isolation of bacterial genes expressed within host cells." Science 277:2007-2011, 1997.

Valdivia RH et al. "Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of host-pathogen interactions". Gene 173:47-52, 1996.

Ormo M et al. "Crystal Structure of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein." Science 273:1392-1395,1997.

Le manuel intitulé "Living Colors User Manual" édité par Clontech

Quelques exemples d'applications en image

Les clichés présentés ici ont été réalisés durant mes divers travaux de recherche. Pour tout renseignement, veuillez me contacter.

Colonies fluorescentes de S. cerevisea obtenues après clonage de l'ADNc de la GFP dans un vecteur d'expression de levure et observées sous lumière UV et visible

Levures en division obtenues par étalement entre lame et lamelle d'une colonie fluorescente (cf. photo ci-dessus). Objectif : x100 immersion huile. Le halo fluorescent autours des levures ne correspond pas à une diffusion de la GFP, mais à un artefact lors de la prise du cliché, du à l'immersion. On peut nettement voir ici que l'expression de la GFP est uniquement cytoplasmique.

Cellules H460MGFP en culture. Objectif : x40. La fluorescence apparait nettement dans le cytoplasme des cellules. Les cellules n'exprimant pas la GFP ne sont plus visibles sous UV.

Micrométastase pulmonaire, obtenue après injection de cellules H460MGFP. Objectif : x40. Sur ce cliché, on peut voir une micrométastase en train de se diviser. Tout autours, on devine le tissu sain de l'hôte. Ceci illustre la puissance de la GFP comme système indicateur.

Micrométastase pulmonaire, obtenue après injection de cellules H460MGFP. Objectif : x20. Sur ce cliché, on peut voir l'évolution d'une micrométastase semblable à celle montrée ci-dessus.

Micrométastase pulmonaire, obtenue après injection de cellules H460MGFP. Objectif : x20. Après quelques temps, la micrométastase grossit...

Macrométastase pulmonaire, obtenue après 6 semaines.

Coupe de poumon de souris. La métastase présentée ici est révélée par immunohistologie à l'aide d'un anticorps monoclonale anti-GFP (Clontech).

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Présentation du modèle de métastases développé durant mon doctorat (présenté au 4ème Congrès de Pneumologie ; cf. CV webmaster)

Ressources

Ressources bibliographiques

Quelques exemples d'applications en image